A calreticulin gén 9. exon mutációinak kimutatása

A calreticulin gén 9. exon mutációinak kimutatása

DE-KK Laboratóriumi Medicina Intézet Onkológiai Diagnosztikai Részlege 2014. december 1-től új vizsgálatként bevezeti a Calreticulin gén 9. exonjának mutációanalízisét és szekvenálását.

A bcr/abl átrendeződésre negatív krónikus myeloproliferatív kórképek - polycythemia vera (PV), essentialis thrombocytosis (ET) és idiopathias myelofibrosis (IMF) - diagnosztikájának 2005-óta meghatározó eleme a JAK2 gén V617F mutációjának vizsgálata. Később ehhez csatlakozott a JAK2 gén 12. exon mutációinak analízise és az MPL gén W515 mutációjának kimutatása molekuláris biológiai módszerekkel. Nemrégiben a calreticulin fehérje génjének 9. exonjában írtak le genetikai eltéréseket, ami halmozottan és szinte kizárólagosan ET-ban és IMF-ban volt jelen.
A calreticulin egy 48,1 kDa molekulasúlyú fehérje, amely dominálóan az endoplazmatikus retikulumban található meg; egy chaperon molekula, melynek legfontosabb funkciója a protein-folding, oligomer fehérje struktúra összerendeződésének elősegítése. Emellett - miután számos kálcium kötő hellyel rendelkezik - az intracelluláris kálcium háztartás szabályozásában is résztvesz. A 9. exonban bekövetkező deléciók/inzerciók 1 bp-os kereteltolódást okoznak, melynek következtében számos C-terminális kálciumkötőhely elvész, és egy új, közös 36 aminosav hosszúságú C-terminális szakasz jelenik meg a fehérjében. A mutációk hatására a JAK/STAT szignalizációs útvonal fokozott és állandó aktivitása jön létre, aminek szerepe van a fokozott sejtproliferáció fenntartásában.
A calreticulin gén 9. exonjában eddig 55 különböző genetikai eltérést írtak le, ami 16 különböző hosszúságú exonvariánst eredményez. Ezek közül a leggyakoribb - 1. típus, c.1092_1143del - egy 52 bp-os deléció, a pozitív esetek kb. 50%-ban fordul elő; míg, a második - 2. típus, c.1154_1155TTGTC - egy 5 bp-os inzerció, ennek gyakorisága kb. 35%. Míg a PV-ban a JAK2 gén mutációi a betegek kb. 98%-ában kimutathatóak, addig ET-ban és IMF-ban a JAK2 mutációk gyakorisága kb. 50-60%, az MPL mutációké 5-10%, míg a calreticulin eltérések előfordulása 25-35%. Ezek alapján a calreticulin vizsgálat végzése ET-ban és IMF-ban javasolt, bár extrém ritkán PV-ban is írtak már le calreticulin mutációt.  
A leggyakrabban előforduló 2 calreticulin mutáció eltérő klinikai képpel társul. A 2. típusú mutáció magasabb thrombocyta, leukocyta és blast számmal és kedvezőtlenebb kimenetellel jár. Ugyanakkor a 2. típusra jellemező 5 bp-os inzerciót 9 különböző calreticulin eltérés is okozhat. A mutáció szűrőjeként alkalmazott PCR+fragmentanalízis módszer, azonban csak az inzerció nagyságát detektálja, annak pontos helyét nem. Ezért, ha a 2. típusú eltérés egyértelmű azonosítására van szükség, ez DNS szekvenálás segítségével valósítható meg.  

A meghatározás elve:
A calreticulin gén 9. exonját fluoreszcensen jelölt primereket alkalmazó PCR-rel amplifikáljuk, majd a PCR termék méretét kapilláris elektroforézis segítségével értékeljük. A vad allél jelenlétére 265 bp nagyságú termék utal, mutáns allél jelenléte esetén kisebb vagy nagyobb méretű PCR terméket is látunk.
Miután a fragment analízis segítségével csak az inzerció vagy deléció mérete határozható meg, pontos helye nem ezért - külön kérés esetén - bidirekcionális DNS szekvenálással határozzuk meg a pontos genetikai eltérést és az ennek következtében kialakuló fehérje szintű változást. Ez a módszer kb. 10-20% kóros allél jelenlétét tudja kimutatni.

Az eredmény értékelése:
A vizsgálat eredményeként a következő paramétereket adjuk meg.
1., "Calreticulin gén 9. exon mutáció analízis" vizsgálat:
            Calreticulin 9. exon mutáció: pozitív/negatív
            Calreticulin 9. exon inzerció/deléció mérete (bázispár)
            Calreticulin 9. exon mutáns allél/Összes allél arány (%)
2., "Calreticulin gén 9. exon szekvenálás" vizsgálat:
             A mutáció pontos lokalizációja, típusa.

A vizsgálat indikációja:
A krónikus myeloproliferatív betegségek molekuláris genetikai kivizsgálásának javasolt algoritmusa:

Vizsgálatkérés, mintatípus, eredmények közlése
A MEDSOL „KIZMOLPT” és „KIZFLOCY” kérőlapján a “Calreticulin gén 9. exon mutáció analízis” illetve a “Calreticulin gén 9. exon szekvenálás” elnevezés kijelölésével rendelhető meg a vizsgálat. A meghatározáshoz egy cső citráttal vagy EDTA-val alvadásgátolt perifériás vér vagy csontvelői minta szükséges. A vizsgálattal kapcsolatban felmerülő kérdések esetén kérjük forduljanak Dr. Antal-Szalmás Péterhez, az Onkológiai Diagnosztikai részleg vezetőjéhez (50052 vagy 56353-as mellék).
Eredményeket háromhetente egyszer adunk ki. Az “Calreticulin gén 9. exon mutáció analízis” pontértéke 4135 pont (DNS izolálással együtt 8060 pont). a “Calreticulin gén 9. exon szekvenálás” pontértéke 24447 pont (külön DNS izolálással együtt 28372 pont).

 

Debrecen, 2014. november 26.

 

Tisztelettel:
Dr. Kappelmayer János s.k.
egyetemi tanár
a Laboratóriumi Medicina Intézet
igazgatója