Bcr-abl fúzió kimutatása valós idejű RT-PCR segítségével

Tisztelt Kolléga!

A t(9;22) transzlokáció kimutatása kvantitatív, valós idejű RT-PCR illetve nested RT-PCR segítségével

A Klinikai Biokémiai és Molekuláris Patológia Intézet Onkológiai Diagnosztikai részlege 2004. november 15-től új vizsgálatként bevezeti a t(9;22) transzlokáció (bcr/abl génátrendeződés) molekuláris biológiai kimutatását , mely elsősorban a krónikus myeloid leukemia (CML) és akut limfoid leukemia (ALL) diagnosztikájában, az alkalmazott terápia követésében, illetve a prognózis becslésében nyújt segítséget. A vizsgálat egyrészt kvantitatív, valós idejű RT-PCR segítségével történik, melynek alkalmazását a diagnózis megállapításakor és a beteg követése során ajánljuk. A nested RT-PCR ennek kiegészítéseként a t(9;22) átrendeződés molekuláris típusát adja meg pontosan (a diagnóziskor és esetleges második Philadelphia kromoszóma megjelenése esetén) és emellett – miután kb. 10-szer érzékenyebb a másik módszernél – a beteg követése során a kvantitatív módszer negativitása esetén ajánlott elvégezni.

 

A t(9;22) transzlokáció kialakulása során a 9-es és 22-es kromoszóma hosszú karjának egy darabja törik le és cserél helyet egymással, így alakul ki a 9q+ nagyobb és 22q- kisebb kromoszóma és ez utóbbit nevezzük Philadelphia kromoszómának. Az átrendeződés következtében a bcr és abl gének fuzionálnak és egy nagyobb és fokozott tirozinkináz aktivitású abl fehérje jön létre. Attól függően, hogy a törés a bcr gén „minor”, „major” vagy „micro” régiójában következik be a létrejövő fúziós fehérje 190, 210 vagy 230 kDa méretű lesz. Az átrendeződés során fuzionáló bcr és abl exonok alapján a „minor” törés esetében e1a2 és e1a3, a „major” törés esetében b2a2, b3a2, b2a3 és b3a3, a „micro” törés esetében pedig e19a2 típusú transzlokációról beszélünk.

A t(9;22) transzlokáció a CML-es betegek 95%-ban kimutatható és az átrendeződés az esetek 95%-ban a „major” töréspontot érinti és b2a2 valamint b3a2 típusú fúzió jön létre. A felnőttkori ALL 30-35%-ában míg a gyerekkori ALL 5-8%-ában mutatható ki bcr/abl átrendeződés, amelynek molekuláris típusa az esetek 70-75%-ában e1a2 vagy e1a3 típusú, míg 25-30%-ban az átrendeződés a „major” töréspontot érinti. A t(9;22) pozitív ALL fenotípusa leggyakrabban cALL vagy pre-B ALL, is igen gyakori a myeloid marker pozitivitás is. A felnőttkori és gyerekkori AML esetében 6% illetve 1% körüli az átrendeződés előfordulásának gyakorisága és a „minor” töréspont átrendeződései leggyakrabban M4 és M5a fenotípusúak.

A transzlokáció kimutatásának diagnosztikus jelentősége van a CML esetében és a t(9;22) transzkriptek kvantitatív meghatározásának az alkalmazott terápia (különösen a Gleevec) hatékonyságának monitorozásában. Az ALL-es betegek esetében a transzlokáció jelenléte prognosztikai faktor és nagyon rossz prognózist jelent, terápiásan pedig indikálhatja az első remisszióban elvégzett csontvelő transzplantációt.

 

A meghatározás elve:

A transzlokáció kimutatása a mintában lévő RNS-ből történik. Az RNS kiizolálása után azt cDNS-sé írjuk át reverz transzkriptáz enzim segítségével. A kvantitatív, valós idejű PCR a Roche LightCycler készülék és a Roche t(9;22) kit segítségével történik. A PCR reakcióban az átírt cDNS amplifikálására használt 3 primer segítségével a „major” és „minor” törési régiók valamennyi gyakori átrendeződése (b2a2, b3a2, b2a3, b3a3, e1a2) felismerhető. A valós idejű detektálást fluoreszcensen jelölt hibridizációs próbák teszik lehetővé. A PCR reakció lezajlása után valamennyi mintában az alkalmazott software automatikusan meghatározza az ún. áttörési ponthoz tartozó küszöb ciklusszám értéket. (Ez az az első pont, amikor a mintában mért flureszcencia értéke már meghaladja a háttérfluoreszcencia értékét.) Ismert mennyiségő mRNS-t tartalmazó standard-ek segítségével egy mRNS koncentráció vs. küszöb ciklusszám kalibrációs görbét veszünk fel, melynek segítségével meghatározható az egyes mintákban a t(9;22) transzkript mennyisége. Az eltérő sejtszámból és az RNS izolálás illetve cDNS átírás során bekövetkező eltérések kiküszöbölésére minden mintában meghatározzuk egy konstansan expresszált mRNS mennyiségét is, ez esetünkben a glukóz-6-foszfát dehidrogenáz mRNS. A t(9;22) transzkript mennyisége osztva a G6PDH transzkript mennyiségével majd százzal szorozva adja a kvantitálás eredményét.

A nested PCR esetében a „major” (M-bcr) és „minor” (m-bcr) töréspontok átrendeződéseinek vizsgálata külön történik. A M-bcr reakció segítségével a b2a2, b3a2, b2a3, b3a3, míg a m-bcr reakcióval az e1a2, e1a3 átrendeződések mutathatók ki. Az alkalmazott primer párok úgy vannak megtervezve, hogy a különböző átrendeződések esetén különböző hosszúságú PCR termékek keletkeznek, így ezen reakciók segítségével az átrendeződés pontos molekuláris típusa is meghatározható. Az érzékenység fokozására a PCR reakciók termékét egy második („nested”) PCR reakcióba visszük, így egy átlagos, diagnóziskor levett, CML-es betegminta t(9;22) transzkript tartalma még kb. 10000-szeres hígításból is kimutatható, szemben a valósidejű, kvantitatív PCR-rel, ahol megbízhatóan kb. 1000-szeres hígítás detektálható még.

Az eredmény értékelése:

t(9;22) – kvantitálás: Numerikus értékelés: a t(9;22) transzkript mennyisége osztva a G6PDH transzkript mennyiségével szorozva százzal. A diagnózis felállításakor általában ennek értéke 10-100 közötti. A terápia követése során molekuláris remisszióról beszélük ha minimum 3-log csökkenés következik be a kiindulási értékhez viszonyítva. Relapszust 3 egymást követő mintából mért, minimum 1-log emelkedés jelez.

t(9;22) – nested PCR: Szöveges értékelés. Megadásra kerül a vizsgált minta pozitivitása-negativitása és az átrendeződés molekuláris típusa (b2a2, b3a2, b2a3, b3a3, e1a2, e1a3).

 

A vizsgálatkérés módja, az eredmények közlése:

A MEDSOL „KIZMOLPT” kérőlapján a „t(9;22) - kvantitálás” és „t(9;22) - nested PCR” elnevezés kijelölésével rendelhető meg a vizsgálat. A hagyományos kérőlapon is ezt kell bejelölni.

A meghatározáshoz egy cső citráttal, vagy EDTA-val alvadásgátolt vér szükséges. Miután a meghatározás a mintában lévő RNS-ből történik és az rendkívül bomlékony és érzékeny a tárolásra, ezért kérjük, a mintákat a lehető legrövidebb időn belül (maximum 2 óra) a laboratóriumba szállítani . Ennek kontrollálására kérjük, hogy a vérvételi csövön tüntessék fel a pontos mintavételi időt (óra, perc), ennek hiányában a minta nem kerül átvételre a laboratóriumban! A minták feldolgozása már a beérkezés napján elkezdődik, ezért azoknak legkésőbb délután 14.00 óráig a laboratóriumba kell érkeznie, az ezután érkezett mintákból a vizsgálatot nem tudjuk elvégezni! Amennyiben a vizsgálattal kapcsolatban bármilyen kérdés merülne fel kérjük forduljanak Dr. Antal-Szalmás Péterhez, az Onkológiai Diagnosztikai részleg vezetőjéhez (6265, 4997 vagy 4502-ös mellék).

Eredményeket kéthetente egyszer adunk ki. A t(9;22) transzlokáció kvantitatív meghatározásának pontértéke 44590 pont, míg a nested PCR vizsgálaté 18816 pont, ami járóbetegek esetében természetesen nem a klinikát terheli.

 

Debrecen, 2004. november 5.

Dr. Kappelmayer János s.k.
egyetemi docens
a Klinikai Biokémiai és Molekuláris
Patológiai Intézet igazgatója